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核酸的定量是雙光束紫外分光光度計使用頻率較高的功能
  • 發布日期:2017-07-05      瀏覽次數:1600
    •     核酸的定量是雙光束紫外分光光度計使用頻率較高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的高吸收峰的吸收波長260nm。每種核酸的分子構成不一,因此其換算系數不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應的系數。如:1OD的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經過上述系數的換算,從而得出相應的樣品濃度。測試前,選擇正確的程序,輸進原液和稀釋液的體積,爾后測試空缺液和樣品液。然而,實驗并非一帆風順。讀數不穩定可能是實驗者頭痛的題目。靈敏度越高的儀器,表現出的吸光值漂移越大。 
          事實上,雙光束紫外分光光度計的設計原理和工作原理,答應吸光值在一定范圍內變化,即儀器有一定的正確度和度。如EppendorfBiophotometer的正確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動,都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測試時,離子濃度太高,也會導致讀數漂移,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,如TE,可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了大程度減少顆粒對測試結果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值好在0.1-1.。在此范圍內,顆粒的干擾相對較小,結果穩定。從而意味著樣品的濃度不能過低,或者過高(超過雙光束紫外分光光度計的測試范圍)。后是操縱因素,如混合要充分,否則吸光值太低,甚至出現負值;混合液不能存在氣泡,空缺液無懸浮物,否則讀數漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空缺液和樣品,否則濃度差異太大;換算系數和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達到比色杯要求的小體積等多個操縱事項。
     
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