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分光光度計使用方法及注意事項
  • 發布日期:2018-03-07      瀏覽次數:14864
    •      分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統組成。

      一、分光光度計原理

              分光光度計采用一個可以產生多個波長的光源,通過系列分光裝置,從而產生特定波長的光源,光線透過測試的樣品后,部分光線被吸收,計算樣品的吸光值,從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

      單色光輻射穿過被測物質溶液時,被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度(光路長度)成正比,其關系為:A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc  式中:A 為吸光度;I。為入射的單色光強度;I 為透射的單色光強度;T 為物質的透射率;k 為摩爾吸收系數;L 為被分析物質的光程,即比色皿的邊長;c為物質的濃度;

      物質對光的選擇性吸收波長,以及相應的吸收系數是該物質的物理常數。當已知某純物質在一定條件下的吸收系數后可用同樣條件將該供試品配成溶液,測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質的含量。在可見光區,除某些物質對光有吸收外,很多物質本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多,且常使用單色光純度較差的儀器,故測定時應用標準品或對照品同時操作。

      二、分光光度計使用方法步驟

        1)預熱儀器。為使測定穩定,將電源開關打開,使儀器預熱20min,為了防止光電管疲勞,不要連續光照。預熱儀器時和在不測定時應將比色皿暗箱蓋打開,使光路切斷。

        2)選定波長。根據要求,轉動波長調節器,使指針指示所需要的單色光波長。

        3)固定靈敏度檔。根據有色溶液對光的吸收情況,為使吸光度讀數為0.2-0.7,選擇合適的靈敏度。為此,旋動靈敏度檔,使其固定于某一檔,在實驗過程中不再變動。一般測量固定在“1”檔。

        4)調節“0”點。輕輕旋動調“0”電位器,使讀數表頭指針恰好位于透光度為“0”處(此時,比色皿暗箱蓋是打開的,光路被切斷,光電管不受光照)。

        5)調節T=100%。將盛蒸餾水(或空白溶液或純溶劑)的比色皿放入比色皿座架中的*格內,有色溶液放在其它格內,把比色皿暗箱蓋子輕輕蓋上,轉動光量調節器,使透光度T=100%,即表頭指針恰好指在T=100%處。

        6)測定。輕輕拉動比色皿座架拉桿,使有色溶液進入光路,此時表頭指針所示為該有色溶液的吸光度A。讀數后,打開比色皿暗箱蓋。

        7)關機。實驗完畢,切斷電源,將比色皿取出洗凈,并將比色皿座架及暗箱用軟紙擦凈。

      三、分光光度計操作使用過程中的注意事項

        1)為了防止光電管疲勞。不測定時必須將比色皿暗箱蓋打開,使光路切斷,以延長光電管使用壽命。

        2)比色皿的使用方法:

        ①拿比色皿時,手指只能捏住比色皿的毛玻璃面,不要碰比色皿的透光面,以免沾污。

        ②清洗比色皿時,一般先用水沖洗,再用蒸餾水洗凈。如比色皿被有機物沾污,可用鹽酸-乙醇混合洗滌液(1∶2)浸泡片刻,再用水沖洗。不能用堿溶液或氧化性強的洗滌液洗比色皿,以免損壞。也不能用毛刷清洗比色皿,以免損傷它的透光面。

        每次做完實驗時,應立即洗凈比色皿。

        ③比色皿外壁的水用擦鏡紙或細軟的吸水紙吸干,以保護透光面。

        ④測定有色溶液吸光度時,一定要用有色溶液洗比色皿內壁幾次,以免改變有色溶液的濃度。另外,在測定一系列溶液的吸光度時,通常都按由稀到濃的順序測定,以減小測量誤差。

        ⑤在實際分析工作中,通常根據溶液濃度的不同,選用液槽厚度不同的比色皿,使溶液的吸光度控制在0.2~0.7。

      四、分光光度計分操作中容易出現的幾個典型故障及其排除方法

            1)儀器不能調零。可能原因:
       

             ①光門不能*關閉。解決方法:修復光門部件,使其*關閉。

             ②透過率"100%"旋到底了。解決方法:重新調整"100%"旋鈕。

             ③儀器嚴重受潮。解決方法:可打開光電管暗盒,用電吹風吹上一會兒使其干燥,并更換干燥劑。

             ④電路故障。解決方法:送修理部門,檢修電路。

            2)儀器不能調"100%"。可能原因:

             ①光能量不夠。解決方法:增加靈敏度倍率檔位,或更換光源燈(盡管燈還亮)。

             ②比色皿架未落位。解決方法:調整比色皿架使其落位。

             ③光電轉換部分老化。解決方法:更換部件。

             ④電路故障。解決方法:調修電路。

            3) 測量過程中,"100%"點經常變動。可能原因:

            ①比色皿在比色皿架中放置的位置不一致,或其表面有液滴。解決方法:用擦鏡紙擦干凈比色皿表面,然后將其安放在比色槽的左邊,上面用定位夾定位。

            ②電路故障(電壓、光電接收、放大電路)。解決方法:送修。

            4)數顯不穩。可能原因:

             ①預熱時間不夠。解決方法:延長預熱時間至30分鐘左右(部分儀器由于老化等原因,長時間處于工作狀態時,也會工作不穩)。

              ②光電管內的干燥劑失效,使微電流放大器受潮。解決方法:烘烤電路,并更換或烘烤干燥劑。

              ③環境振動過大、光源附近空氣流速大、外界強光照射等。解決方法:改善工作環境。

              ④光電管、電路等其它原因。解決方法:送修。

     
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